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Primera edición. Mayo de 2020
ISBN: 978-84-17403-63-8
Cómo citar este libro: TÉCNICAS ÓMICAS APLICADAS AL ESTUDIO DE LA MICROBIOTA, 1ª edición, 2020. Abelardo Margolles Barros, Editorial Amazing Books, ISBN 978-84-17403-63-8
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En un mundo cada vez más preocupado por el entorno, por lo que nos rodea, por su alimentación y por su salud y más concretamente por los productos biológicos, por los superalimentos, por el bienestar animal, por la procedencia de lo que se come…, las Técnicas Ómicas aparecen para contribuir al estudio de la totalidad de microbios existentes en los seres vivos. A este conjunto de microorganismos se les denomina microbiota y los podemos encontrar en el aparato digestivo, en el reproductor, en el respiratorio, en la boca, en la piel…, en definitiva, sobre todo en las zonas de mayor humedad del organismo.
La relación de simbiosis entre humano y los miembros de la microbiota es el resultado evolutivo de una interacción biológica en la que, normalmente, una o ambas partes obtienen beneficio.
Los microorganismos residentes nos defienden de infecciones mientras mantienen su nicho ecológico, utilizan la fibra vegetal que ingerimos para obtener energía y metabolitos, que son aprovechados por nuestras células, incluso, nos protegen contra enfermedades mientras aseguran su hábitat. Sin embargo, durante la vida hay amenazas a nuestra microbiota que provocan como daño colateral una pérdida de microbios beneficiosos, cuya naturaleza y consecuencias no se ha cuantificado por completo. Ahora sabemos que el estilo de vida actual ha ejercido un fuerte impacto en nuestra microbiota y que algunos de los microorganismos ancestrales y los genes que estos contienen han ido perdiéndose o disminuyendo.
Esta disminución en la biodiversidad ha ocurrido y está ocurriendo pese a que la naturaleza se asegura de que los microorganismos que componen la microbiota pasen de una generación a otra a través del canal del parto y, posteriormente, a través del contacto y la lactancia. Una pregunta importante es: ¿cuándo se estabiliza, si llega a hacerlo, la microbiota de un individuo? Estudios recientes han sugerido que es a partir de los tres años cuando, de forma general, se puede considerar que se adquiere una microbiota estable, si bien hay muchos factores que la pueden modular antes, durante y después de este periodo. De hecho, el balance ecológico entre el huésped y su microbiota puede ser modificado por agentes externos, de forma que las bacterias pueden asestar un golpe genotóxico en determinadas condiciones.
Nuestra microbiota experimenta cambios, como consecuencia de la influencia de múltiples factores, de un modo similar a los que experimenta cualquier órgano de nuestro cuerpo desde la ontogenia a la muerte. Estos cambios pueden ocurrir en cuestión de días, como ocurre durante la ingesta de antibióticos, o a más largo plazo durante la exposición continuada a una dieta. Estos cambios o alteraciones, independientemente de cuándo ocurran, pueden ser muy importantes, ya que pueden definir o influenciar en mayor o menor grado nuestra salud y la resistencia o predisposición a enfermedades. Es difícil establecer los parámetros que definen una microbiota normal, pero sí existe un consenso de que cuanta más diversidad albergue, mejor será.
Índice
Prólogo
Autores
Capítulo 1 Tecnologías de secuenciación masiva
1.1 Dónde hemos llegado: tres generaciones de secuenciadores
1.2 Genomas completos: desde la fuerza bruta a la elegancia
1.3 Metagenómica: todas las piezas cuentan
1.4 Metataxonomía: papeles para todos
Capítulo 2 Del gen a la función: metatranscriptómica, metaproteómica y metabolómica microbiana
2.1 Microbiota: evolución y cambios similares a los que experimenta cualquier órgano
2.2 Niveles en la jerarquía funcional y técnicas de análisis
2.3 Filotipado y metagenómica: ejemplos prácticos que muestran su utilidad
2.4 Metaproteómica y metabolómica: ejemplos prácticos que muestran su utilidad
2.5 Empresas dedicadas al análisis de microbiota
2.6 Conclusiones
Capítulo 3 Herramientas bioinformáticas
3.1 Metataxonómica y metagenómica: composición, abundancia y variación
3.2 Metatranscriptómica: perfiles de expresión genética
3.3 Metaproteómica: comparación de perfiles proteicos
3.4 Metabolómica: identificación de metabolitos microbianos
3.5 Fluxómica: análisis de flujos metabólicos
3.6 Conclusiones
Capítulo 4 El efecto del genoma del huésped en el microbioma intestinal
4.1 Heredabilidad
4.2 Genes candidatos
4.3 Análisis de asociación de genoma completo y microbioma
4.4 Genes y rutas metabólicas consistentemente asociados con el microbioma
4.5 Retos y pasos futuros
Capítulo 5 La metabolómica: una herramienta esencial en el estudio del metabolismo y la microbiota
Capítulo 6 Integración de técnicas ómicas en el estudio de la microbiota intestinal
6.1 Estabilidad, resistencia, resiliencia y redundancia funcional
6.2 Técnicas ómicas aplicadas al estudio de la microbiota intestinal
Capítulo 7 Microbiota mamaria
7.1 Introducción
7.2 Estudios basados en las técnicas de cultivo
7.3 Estudios basados en técnicas independientes de cultivo
7.4 Ómicas aplicadas al estudio del microbioma de la leche materna: metataxonómica y metagenómica total
7.5 Factores que influyen en la composición de microbiota/microbioma de la leche humana
7.6 Disbiosis mamarias: mastitis
7.7 Otras ómicas aplicadas al estudio del microbioma de la leche materna: proteómica, transcriptómica y metabolómica
7.8 Limitaciones, retos y perspectivas futuras
Capítulo 8 Ginómica (microbiota vaginal)
8.1 Genómica y taxonomía
8.2 Genómica y patología
8.3 Transcriptómica
8.4 Proteómica
8.5 Metabolómica
8.6 Resumen
Director de la obra
Abelardo Margolles Barros
Doctor en Farmacia. Profesor de Investigación del CSIC adscrito al Instituto de Productos Lácteos de Asturias. Grupo de Investigación de Funcionalidad y Ecología de Microorganismos Beneficiosos.
Autores
Rafael Bargiela Bargiela
School of Natural Sciences, Bangor University, Bangor, Reino Unido.
Investigador Postdoctoral de la Universidad de Trento. Doctor en Ingeniería Informática por la Universidad de Vigo.
Xavier Correig Blanchar
Catedrático en el Departamento de Ingeniería Electrónica de la Universitat Rovira i Virgili (URV). Doctor Ingeniero de Telecomunicación por la Universidad Politécnica de Catalunya. Director de la Plataforma Metabolómica del CIBER en Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM), el Institut d’Investigació Sanitària Pere Virgili (IISPV) y la URV. Responsable del Grado de Ingeniería Biomédica de la URV y Coordinador del Grupo de I+D+I Metabolomics Interdisciplinary Laboratory (MiL@b).
Mauro D’Amato
Professor of Genetics and Genomics, School of Biological Sciences, Monash University, Clayton, Australia. Visiting Professor of Gastrointestinal Genetics, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Stockholm, Suecia. Ikerbasque Research Professor, Biodonostia Health Research Institute, San Sebastián, España.
Giuseppe D’Auria
Servicio de Secuenciación y Bioinformática, Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y Biomédica (FISABIO). Consorcio de Investigación Biomédica en Red en Epidemiología y Salud Pública (CIBERESP), Valencia.
Manuel Ferrer Martínez
Instituto de Catálisis, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid.
Koldo García Etxebarria
Biodonostia, Grupo de Genética Gastrointestinal. Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd). San Sebastián, España.
Llucia Martínez Priego
Servicio de Secuenciación y Bioinformática, Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y Biomédica (FISABIO), Valencia.
Celia Méndez-García
Instituto de Catálisis, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid.
Andrés Moya Simarro
Catedrático de Genética, Universitat de València. Doctor en Biología y Filosofía por la Universitat de València. Director de la Cátedra Institucional FISABIO de la Universitat de València. Instituto de Biología Integrativa de Sistemas de la Universitat de València y Consejor Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), València, en la Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunidad Valenciana (FISABIO-Salud Pública), València, y en el Centro de Investigación Biomédica en Red en Epidemiología y Salud Pública (CIBERESP), Madrid.
Vicente Pérez Brocal
Doctor en Biología por la Universitat de València. Investigador del Área de Genómica y Salud de la Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunidad Valenciana (FISABIO-Pública), València y del Centro de Investigación Biomédica en Red en Epidemiología y Salud Pública (CIBERESP), Madrid.
Juan Miguel Rodríguez Gómez
Doctor en Veterinaria. Catedrático de Universidad. Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Universidad Complutense de Madrid.
Lorena Ruiz García
Investigadora. Doctora en Biología por la Universidad de Oviedo. Miembro del Grupo Funcionalidad y Ecología de Microorganismos Beneficiosos (MICROHEALTH). Departamento de Microbiología y Bioquímica de Productos Lácteos. Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC).
Susana Ruiz Ruiz
Doctora en Biología por la Universitat de València. Investigadora del Área de Genómica y Salud de la Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunidad Valenciana (FISABIO-Salud Pública), València y del Centro de Investigación Biomédica en Red en Epidemiología y Salud Pública (CIBERESP), Madrid.
Borja Sánchez García
Científico Titular del CSIC. Doctor por la Universidad de Oviedo. Consejero de Ciencia, Innovación y Universidad del Gobierno del Principado de Asturias.
Juan Evaristo Suárez Fernández
Catedrático de Microbiología. Profesor de Microbiología Sanitaria en los Grados de Enfermería y Medicina. Universidad de Oviedo.
No existe en nuestro planeta prácticamente un lugar donde no podamos encontrar bacterias, hallándolas en los sitios más inhóspitos como en la Antártida, en los géiseres de Islandia o en el desierto del Sáhara. Por tanto, están tanto en el exterior como en el interior de los seres vivos. Se estima que en un gramo de arena hay diez millones de bacterias y, solamente, en un mililitro de agua de un río, un millón. Son los seres vivos más numerosos en el planeta, calculándose que hay del orden de cinco quintillones (o cinco billones de trillones), es decir, un trillón de bacterias por cada persona viva.
En general, se considera que crecen en las placas de cultivo, por eso, son visualizados por el microscopio solo un 10% de las bacterias. Hasta la fecha, hay más de 13.000 especies clasificadas, aunque, seguramente, haya muchísimas más sin clasificar, como mínimo otras 30.000, por lo que conocemos una parte muy limitada del mundo bacteriano. Afortunadamente, el 99,994% de las clasificadas hasta la fecha son inocuas para el hombre; es más, muchas son imprescindibles, ya que son responsables del mantenimiento de los ciclos biogeológicos. Además, han intervenido desde siempre en nuestra dieta, produciendo alimentos y bebidas fermentadas como el yogur o los productos encurtidos.
A pesar de ello, el estudio de la microbiota ha permanecido bastante estancado durante la mayor parte del siglo XX debido a que no se habían desarrollado tecnologías que permitieran el análisis adecuado de las complejas comunidades microbianas que habitan en nuestro organismo y de la enorme variedad de interacciones que se producen. Este conocimiento ha cambiado radicalmente en los últimos años con la caracterización del microbioma humano, secuela científica de la publicación de los primeros borradores del genoma humano los días 15 y 16 de febrero de 2001 en las prestigiosas revistas Nature y Science, que supusieron un hito en la historia de la biomedicina. El advenimiento de las técnicas genómicas y, con ellas, de la proteómica y la metabolómica, ha venido a paliar aquella deficiencia y ha promovido un enorme esfuerzo a nivel mundial para conocer ese mundo que nos es tan próximo, pero a la vez tan ignorado.
Sin embargo, a pesar del esfuerzo ya realizado, aún estamos en el comienzo de nuestro conocimiento sobre la microbiota y su influencia sobre la salud y la aparición de enfermedades, por lo que se abre ante nosotros un campo muy extenso de posibilidades de desarrollo de nuevas indicaciones y procedimientos terapéuticos, incluso personalizados, que prometen avances significativos en nuestra percepción de lo que significa la salud. Seguramente, estemos ante una nueva era en el estudio de la relación entre las bacterias y el cuerpo humano, cuyas investigaciones aportarán nuevas aplicaciones en el tratamiento y prevención de numerosas enfermedades. Se trata de una de las revoluciones científicas más importantes de la medicina del futuro.
La Sociedad Española de Microbiota, Probióticos y Prebióticos (SEMiPyP) es una organización científica sin ánimo de lucro, fundada en 2010, dedicada al fomento y a la difusión del conocimiento científico y la investigación, la aplicación clínica y la divulgación sobre microbiota de las regiones corporales, probióticos y prebióticos y su impacto en la salud. Los profesionales que la integran (alrededor del millar de socios) pertenecen a varias disciplinas: médicos, farmacéuticos, veterinarios, microbiólogos, investigadores básicos, inmunólogos, nutricionistas, matronas, etc. La SEMiPyP cuenta con un consejo asesor industrial que le presta asesoramiento, respetando siempre su independencia. El prestigio que los investigadores dan a nuestra sociedad le otorga un carácter único e interdisciplinar a una asociación científica, no solo integrada por profesionales sanitarios, que se traduce en un gran reconocimiento a nivel nacional e internacional.
Por último, quiero agradecer a todos los autores, expertos en la materia, su excelente aportación al libro con el desarrollo de los distintos temas, en particular, al profesor Abelardo Margolles Barros, coordinador de la obra, miembro fundador de la SEMiPyP y uno de los investigadores más activos de nuestra sociedad. Quiero también expresar mi agradecimiento a la editorial Amazing Books por las facilidades mostradas en la elaboración, publicación y difusión de un proyecto que nació a partir de los exitosos talleres prácticos sobre Técnicas Ómicas desarrollados en los distintos workshop de la SEMiPyP.
Guillermo Álvarez Calatayud
Presidente de la Sociedad Española de Microbiota, Probióticos y Prebióticos
Las descripciones de las poblaciones microbianas de ambientes naturales, así como aquellas relacionadas con organismos superiores, pasaron a finales del siglo pasado por un punto de inflexión debido al desarrollo de las tecnologías de secuenciación masiva. El impulso que la secuenciación masiva ha proporcionado a la biología molecular procede fundamentalmente de la eliminación de los pasos de clonaje acelerando los procesos y abaratando los costes por base secuenciada. Para entender el avance que ha supuesto hay que recordar que los primeros trabajos de metagenómica estuvieron basados en la extracción directa del ADN total de una comunidad microbiana, fragmentándolo e insertándolo en plásmidos o BACs (del inglés, Bacterial Artificial Chromosome) de bacterias de laboratorio (generalmente Escherichia coli), obviando así la necesidad de cultivo. Los clones obtenidos podrían entonces utilizarse para la secuenciación de tipo Sanger y posterior estudio funcional1. Este proceso se llevaba a cabo en serie (un clon tras otro) y aplicando la fuerza bruta, es decir, secuenciando el número suficiente de clones y de fragmentos de ADN que permitiera describir los organismos. El salto que supuso poder estudiar también los organismos no cultivables permitió entender mejor y describir cómo los organismos no viven aislados, sino en continua interacción con comunidades microbiológicas complejas en prácticamente cualquier ambiente.
Tras este primer avance, en la primera década de este nuevo siglo, aparece por primera vez una nueva generación de secuenciadores llamados secuenciadores «masivos» o secuenciadores de «segunda generación» (la secuenciación Sanger se considera la «primera generación»). Estos secuenciadores permitieron pasar de la secuenciación en serie (clon por clon) a la secuenciación en paralelo de cientos de miles de fragmentos de ADN en una sola reacción, evitando el costoso paso del clonaje y abaratando los costes y los tiempos. Estos avances, junto con la reducción de la cantidad de ADN requerido para la construcción de las librerías, ha posibilitado la expansión de los estudios metagenómicos así como la creación de consorcios locales o internacionales destinados a analizar y comprender la diversidad génica y poblacional de los distintos microbiomas en prácticamente todos los ambientes conocidos. También se ha disparado el número de proyectos de metataxonomía basados en la descripción de las distribuciones de amplicones del gen ribosomal 16S, conocido como la etiqueta taxonómica más importante por su estabilidad evolutiva2.
Es importante también señalar cómo estos avances han ido de la mano con otros procedentes del mundo de la informática, donde procesadores cada vez más potentes han hecho posible el almacenamiento y análisis de esta cantidad masiva y creciente de datos, dando origen a una nueva disciplina, la bioinformática. En su comienzo asistimos a un avance muy «creativo», dando tumbos según las capacidades y la inventiva de los biólogos que se acercaban a la biología computacional confluyendo finalmente en la nueva figura del bioinformático. Finalmente, nuevos estándares en términos de calidad, descripción de los datos y métodos de análisis empiezan a afirmarse para contener el caos inicialmente generado por tanta información, llegada en tan poco tiempo a la portada de todos los grupos de investigación.
-Primera generación. Los primeros abordajes a la secuenciación masiva empiezan con la aparición de instrumentos automatizados de secuenciación de tipo Sanger basados en el análisis seriado de fragmentos de ADN clonados. El número de fragmentos que se podían obtener por unidad de tiempo era dependiente del número de capilares del secuenciador, donde cada uno de ellos realizaba una electroforesis individual. Las lecturas así obtenidas estaban caracterizadas por una alta calidad (medida como la probabilidad inversa de que la base no fuera correcta), con una longitud de hasta 900 pb. Las secuencias se visualizaban y comprobaban de una en una pudiendo generar cientos de secuencias al día por un coste de unos pocos euros por secuencia.
-Segunda generación. Empieza la secuenciación masiva o en paralelo. Estas tecnologías tienen en común la fragmentación de los genomas y la amplificación clonal de los fragmentos obtenidos. Finalmente, mediante la inclusión de los clones en gotas de aceite (emulsion PCR) o su inmovilización en una superficie sólida, consiguen amplificar la señal necesaria para detectar la secuencia de las bases nucleotídicas. La diferencia entre los secuenciadores y las diferentes tecnologías radica en la diferente química que aplican para detectar la señal. La primera aproximación a la secuenciación masiva en paralelo se basó en la pirosecuenciación del ADN3. Esta tecnología fue desarrollada por la empresa 454 Life Sciences, que fue absorbida después por la empresa Roche. El último modelo que comercializó en 2010, el GS-FLX-Titanium+ generaba lecturas de hasta 800 bases al ritmo de 100 millones de bases cada 4 horas. Otras compañías desarrollaron otro tipo de tecnologías: la compañía Solexa (desde 2007 illumina) desarrolló un método basado en la polimerización del ADN y la compañía SOLiD (Sequencing by oligonucleotide ligation and detection), un método basado en la detección de fluorescencia por ligación de sondas. Ambas técnicas tienen la gran ventaja sobre la pirosecuenciación de resolver de forma fiable las regiones homopoliméricas (repeticiones de las mismas bases), sin embargo, su gran desventaja radica en que no son capaces de generar lecturas largas. Otra compañía, IonTorren Systems Inc. (en la actualidad, comercializado por ThermoFisher) desarrolló un método basado en la detección de variaciones de pH durante la polimerización. Actualmente, el máximo de longitud lo alcanzan los secuenciadores de tipo MiSeq de illumina con secuencias emparejadas de 2x300 pb, es decir, no más de 600 pb frente a los 800 pb que tenía la pirosecuenciación (y los 900 pb con los que se podía llegar con el método de Sanger de primera generación).
-Tercera generación.single molecule real time sequencing4