Inhaltsverzeichnis
Decken
Titel
Autor
Impressum
Vorwort
Zusatzmaterial: Power-Point Animationen
Abkürzungen
1: Einleitung
1.1 Historische Entwicklung und Bedeutung der Enzyme, ein Überblick
1.2 Wie sind Enzyme entstanden?
1.3 Ribozyme
1.4 Weiterführende Literatur über Enzyme
1.5 Literatur
2: Struktur der Enzyme
2.1 Primärstruktur
2.2 Sekundärstruktur
2.3 Tertiärstruktur
2.4 Quartärstruktur
2.5 Verlauf der Proteinfaltung
2.6 Katalytisches Zentrum und Coenzyme
2.7 Literatur
3: Enzymklassen, Enzymnomenklatur
3.1 Klasse 1: Oxidoreduktasen
3.2 Klasse 2: Transferasen
3.3 Klasse 3: Hydrolasen
3.4 Klasse 4: Lyasen
3.5 Klasse 5: Isomerasen
3.6 Klasse 6: Ligasen
3.7 Literatur
4: Allgemeine Eigenschaften von Enzymen, Enzymtests
4.1 Woran erkennt man ein Enzym?
4.2 Wie werden Enzyme getestet und was ist dabei zu berücksichtigen?
4.3 pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität
4.4 Temperaturabhängigkeit der Enzymaktivität
4.5 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Ionenstärke
4.6 Allgemeine Regeln für Enzymtests
4.7 Aufbewahrung von Enzymen
4.8 Sicherheitsvorkehrungen beim Arbeiten mit Enzymen
4.9 Vorgehensweise beim Enzymtest
4.10 Auswertung von Enzymtests, Enzymeinheiten
4.11 Wie bestimmt man die Umsatzgeschwindigkeit von Enzymen?
4.12 Vom Einzelnachweis zum Massentest
4.13 Statistische Behandlung von Daten aus Enzymuntersuchungen
4.14 Literatur
5: Methoden für Enzymuntersuchungen
5.1 Optische Methoden
5.2 Elektrochemische Methoden
5.3 Methoden zur Messung schneller Reaktionen
5.4 Literatur
6: Enzymisolierung
6.1 Wie gewinnt man Enzyme?
6.2 Wie reinigt man Enzyme?
6.3 Fällungsmethoden
6.4 Ultrafiltration und Dialyse
6.5 Zentrifugation
6.6 Säulenchromatografische Methoden
6.7 Elektrophoretische Methoden
6.8 Literatur
7: Ligandenbindung
7.1 Wie findet das Substrat sein Enzym?
7.2 Worauf beruht die Stärke einer Bindung und wie kann man sie quantifizieren?
7.3 Formulierung der Bindungsgleichung
7.4 Wie misst man die Ligandenbindung?
7.5 Literatur
8: Kinetische Behandlung von Enzymreaktionen
8.1 Reaktionsordnung
8.2 Michaelis-Menten-Gleichung
8.3 Rückreaktion
8.4 Literatur
9: Enzymhemmung
9.1 Kategorien der Enzymhemmung
9.2 Reversible Enzymhemmung
9.3 Literatur
10: Mehrsubstratreaktionen
10.1 Darstellungsweise von Mehrsubstratreaktionen
10.2 Die verschiedenen Mechanismen der Mehrsubstratreaktionen
10.3 Analyse von Mehrsubstratreaktionen
10.4 Literatur
11: Allosterische Enzyme
11.1 Grundlagen der Kooperativität
11.2 Symmetrie-Modell und allgemeine Betrachtungen zu allosterischen Enzymen
11.3 Sequenz-Modell und negative Kooperativität
11.4 Kinetische Kooperativität, das Slow-Transition-Modell
11.5 Literatur
12: Passgerechte Enzyme: Immobilisierung, Enzymreaktoren und künstliche Enzyme
12.1 Immobilisierung von Enzymen
12.2 Enzymreaktoren
12.3 Künstliche Enzyme
12.4 Literatur
13: Enzyme im praktischen Gebrauch
13.1 Enzyme in der Industrie
13.2 Enzyme in Medizin und Therapie
13.3 Literatur
14: Ausblick
14.1 Literatur
Sachverzeichnis
End User License Agreement
List of Illustrations
1: Einleitung
Abb. 1.1 Struktur von Serumalbumin. Aminosäuren sind als rote Kreise dargestellt, Cysteine, die Disulfidbrücken bilden, sind gelb. Den drei repetitiven Domänen I–III sind verschiedenfarbigen Rechtecke unterlegt. Die einander entsprechenden Schleifen 1–9 sind links durchnummeriert. Von Disulfidbrücken eingeschlossene Bereiche sind blau markiert, wobei die erste Schleife ihre Disulfidbrücke offenbar im Laufe der Evolution verloren hat (Nach Brown, J.R. und Shockely, P. (1982) Lipid-Protein-Interactions (Hrsg. P. Jost und O.H. Griffith), Bd. 1, John Wiley & Sons, S. 25–68)
Abb. 1.2 Mechanismus einer von der rRNA des Ribosoms katalysierten Peptidsynthese (nach Nissen et al. (2000) Science, 289, 920–930)
2: Struktur der Enzyme
Abb. 2.1 Grundstruktur der α-Aminosäuren. In Lösung liegt das Molekül als Zwitterion vor
Abb. 2.2 Struktur und Einteilung proteinogener Aminosäuren. Gezeigt ist für jede Aminosäure nur die Seitenkette, darunter grün unterlegt die allen gemeinsame Grundstruktur, wobei Prolin als Iminosäure abweicht. Angegeben für jede Aminosäure ist der Drei- und Einbuchstabencode
Abb. 2.3 Knüpfen der Peptidbindung unter Bildung eines Dipeptids
Abb. 2.4 Sekundärstrukturen von Proteinen. (a) α-Helix in der Ansicht von oben (links) und von der Seite (rechts). Die nach außen gerichteten Aminosäurereste („R“) erscheinen in fortlaufender Nummerierung, Zahlen und Farbcodierung zeigen die Unterschiedlichkeit der Reste. Wasserstoffbrücken sind als grüne gestrichelte Linien dargestellt. (b) Faltblattstruktur in paralleler Anordnung; (c) Faltblattstruktur in antiparalleler Anordnung; (d) Kehre (engl. hairpin loop)
Abb. 2.5 Supersekundärstrukturen von Proteinen, gelbe Zylinder stellen α-Helices, rote Pfeile β-Faltblattstrukturen dar. Antiparallele Faltblattstrukturen (Mitte) können durch eine einfache Kehre verbunden werden, parallele Faltblattstrukturen benötigen zur Verbindung eine längere strukturelle Einheit, häufig eine Helix
Abb. 2.6 Tertiärstrukturen von Proteinen. (a) Fassstruktur (engl. TIM barrel, der Triose-Isomerase angeglichen), bestehend aus acht α-Helices (Zylinder) und acht Faltblattstrukturen (Pfeile). Der in der Mitte verbleibende Hohlraum, in den die an der Katalyse beteiligten Aminosäurereste hineinragen, ist durch einen Kreis symbolisiert; (b) antiparallele β-Struktur, der Superoxid-Dismutase angeglichen. Die Zahlen geben die Reihenfolge der β-Stränge vom Amino- zum Carboxyende an; (c) Rossmann-Faltung der NAD-Bindungsdomäne der LDH
Abb. 2.7 Arten der Verknüpfung von Untereinheiten oligomerer Enzyme. A und B sind unterschiedliche Verknüpfungsstellen
Abb. 2.8 Wirkungsweise der Proteindisulfid-Isomerase (PDI) am Beispiel des pankreatischen Trypsininhibitors. Die Zahlen geben die reaktiven Sulfidgruppen an in der Folge vom Aminozum Carboxyende
Abb. 2.9 Wirkungsweise der Peptidylprolyl-Isomerase. Peptidbindungen in Nachbarschaft zu Prolin, die in der cis-Konformation vorliegen, überführt das Enzym in die trans-Konformation
Abb. 2.10 Wirkungsweise der Chaperonine. GroEL ist ein Proteinkomplex bestehend aus 14 identischen Proteineinheiten, die sich in zwei übereinander gelagerten Ringe zu je sieben Untereinheiten anordnen. Jede Proteinuntereinheit besteht wiederum aus drei Domänen. Ent- oder fehlgefaltete Proteine binden an einen der Ringe, daraufhin binden sieben ATP an die Untereinheiten dieses Rings, der in Folge seine Konformation ändert. Das aus sieben Untereinheiten bestehende GroES schließt als Deckel den Innenraum nach außen hin ab. Unter Spaltung von ATP faltet sich das eingeschlossene Protein um. Sieben ATP binden an den unteren Ring, wodurch sich der GroES-Deckel ablöst und den Ausgang für das nunmehr native Protein freigibt. ADP verlässt den oberen Ring, der Zyklus kann erneut beginnen
Abb. 2.11 Biotin als Cofaktor der Acetyl-CoA-Caroxylase-Reaktion. Schritt 1: Bindung und Aktivierung von CO2 an Biotin unter ATP-Verbrauch. Schritt 2: Carboxylierung von Acetyl-CoA u nter Regenerierung des Biotins
Abb. 2.12 An der Reaktion des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes beteiligte Cofaktoren. Die Fixierung der Liponsäure als prosthetische Gruppe sowie die verschiedenen Komponenten, aus denen sich die Coenzyme zusammensetzen, sind hervor gehoben. Coenzymstrukturen sind in blauer Schrift, Substrate in roter Schrift dargestellt. Die Reaktion von NAD, dem fünften an dieser Reaktionssequenz beteiligten Coenzym, ist in Abb. 2.16 dargestellt. –P–P– ist eine Diphosphatgruppe.
Abb. 2.13 Beteiligung von Pyridoxalphosphat an der Transaminierungsreaktion
Abb. 2.14 Reaktionen des Tetrahydrofolats. Oben ist das gesamte Molekül mit seinen Teilkomponenten dargestellt, darunter das durch Anlagerung einer Methylengruppe des Serins gebildete Methylentetrahydrofolat. Für die anderen Formen ist jeweils nur der relevante Bereich innerhalb der gelben Markierung gezeigt
Abb. 2.15 Struktur von 5′-Desoxyadenosylcobalamin
Abb. 2.16 Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) und Nicotinaminadenindinukleotidphosphat (NADP). Für die reduzierte Form ist nur die Nicotinamidgruppierung gezeigt. Bei NAD entfällt die untere schraffiert unterlegte Phosphatgruppe an der 2′-Position der Adenosinribose, stattdessen gilt das gelb eingekreiste Wasserstoffatom, für NADP gilt das Umgekehrte. Der Angriff des Substrats erfolgt stereospezifisch nur von einer Seite, im Falle der ADH und LDH wie oben gezeigt von der re-Seite
Abb. 2.17 Oxidierte, halbreduzierte und reduzierte Form von Coenzym Q
Abb. 2.18 Eisen-Protoporphyrine. Häm c, die prosthetische Gruppe des Cytochroms c, ist über zwei Cysteinreste mit dem Protein verbunden. Das Cytochromprotein, in dessen aktivem Zentrum die Hämgruppe sitzt, ist als grüner Ring angedeutet. Das Eisenatom, das in der zwei- und der dreiwertigen Stufe vorliegen kann, ist vierfach über Stickstoffatome des Protoporphyrinrings koordiniert. Die beiden anderen Koordinationsstellen besetzen ein Histidin- und ein Methioninrest des Proteins
Abb. 2.19 Eisen-Schwefel-Cluster mit einem, zwei und vier Eisenatomen (a). (b) Eisen-Molybdän-Cofaktor der Nitrogenase
Abb. 2.20 Molybdopterin
3: Enzymklassen, Enzymnomenklatur
Abb. 3.1 Katalytischer Mechanismus der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase. P: Phosphatgruppe
Abb. 3.2 Zusammenwirken der katalytischen Zentren des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes. E1: Pyruvat-Dehydrogenase-Komponente; E2: Dihydroliponamid-Acetyltransferase-Komponente; E3: Dihydroliponamid-Dehydrogenase-Komponente. An der zweifach dargestellten E2-Komponente ist das für den Katalysemechanismus nicht notwendige, aber für die Komplexstruktur wichtige Weiterreichen des Acetylrests über mehrere Liponsäurereste (Transacetylierung) dargestellt
Abb. 3.3 Quartärstruktur des bakteriellen Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (a). In (b) sind die E1- und E3-Untereinheiten weitgehend entfernt, um die innere Würfelstruktur der E2-Komponente sichtbar zu machen
Abb. 3.4 Schematischer Aufbau der Aspartat-Carbamoyltransferase aus jeweils sechs katalytischen (grün) und regulatorischen (violett) Untereinheiten. Links der wenig aktive T-Zustand, rechts der aktive R-Zustand. Oben und unten sind die Biosynthesewege der Pyrimidin- und Purinnukleotide und deren wechselseitige Beeinflussung der Aktivität des Enzyms. Substrate sind blau, Aktivatoren grün und Hemmstoffe rot markiert. Es ist jeweils nur die Bindung an eine Untereinheit gezeigt
Abb. 3.5 Struktur der Fettsäure-Synthase aus Säugetieren. Schematische Darstellung der Domänen und der Anordnung der zwei identischen Untereinheiten. Die beiden Core-Domänen separieren das Enzym in zwei Hälften. Jede Hälfte kann die gesamte Reaktionssequenz ausführen, wobei Domänen aus beiden Untereinheiten zusammen wirken. Die katalytischen Einheiten jeder Hälfte sind ringförmig angeordnet. In dem dadurch gebildeten Freiraum agiert das Acyl-Carrier-Protein (ACP), indem es mit allen katalytischen Zentren in Wechselwirkung tritt. KS, β-Ketoacyl-Synthase; MAT, Malonyl/Acetyl-Transferase; DA, 3-Hydroxyethyl-Hydratase; ER, Enoyl-Reductase; KR, β-Ketoacyl-Reductase; TE, Thioesterase
Abb. 3.6 Reaktionen der multifunktionellen Fettsäure-Synthase. Enzyme in den weißen Bereichen sind nicht in die Fettsäure-Synthase integriert
Abb. 3.7 Regulation des Glykogen-Stoff-wechsels. GP, Glykogen-Phosphorylase; GS, Glykogen-Synthase; G1P, Glucose-1-phosphat; G6P; Glucose-6-phosphat; GSK, Glykogen-Synthase-Kinase; PK A, Proteinkinase A; PhK, Phosphorylase-Kinase; PP1, Proteinphosphatase 1; IRS, Insulin-Rezeptor-Substrate
Abb. 3.8 Mechanismus der Transaminierungsreaktion. Nach Ablösen der α-Ketosäure läuft die Reaktion durch Angriff einer zweiten α-Ketosäure sinngemäß zurück, der Rest R entspricht dann der zweiten α-Ketosäure bzw. der daraus entstehenden Aminosäure
Abb. 3.9 Wirkungsweise von Lipasen. Die roten Pfeile zeigen die Spaltungsstellen der jeweiligen Lipasen. Im unteren Teil der Abbildung ist rechts nur die Spaltung durch die Phospholipase A2 , die Lysophospholipase, ausgeführt. Der Glycerinanteil ist blau unterlegt, gesättigte Fettsäuren blassgelb, ungesättigte intensiv gelb
Abb. 3.10 Aktives Zentrum von Serinproteasen. Die Zentren von Chymotrypsin und Trypsin sind für voluminöse Aminosäurereste frei zugänglich. Chymotrypsin spaltet daher besonders nach großen aromatischen Resten, während Trypsin aufgrund der negativen Ladung im aktiven Zentrum basische Reste bevorzugt. Bei Elastase ragen große Gruppen in das aktive Zentrum, während Chymotrypsin und Trypsin Glycinreste an dieser Stelle besitzen. Daher kann Elastase nur kleinere Seitengruppen akzeptieren (nach Branden, C. und Tooze, J. (1998) Introduction to Protein Structure, Garland)
Abb. 3.11 Proteolytische Spaltung durch die katalytische Triade des Chymotrypsins. Das Peptidsubstrat bindet an Serin 195 (R1 und R2 sind Peptidketten). Es folgt eine Umlagerung zu einem tetraedrischen Zwischenprodukt. Die Peptidbindung wird gespalten, eine Peptidylkette wird freigesetzt, die andere verbleibt am Enzym und bildet ein Acyl-Enzym. Wasser lagert sich an und setzt die zweite Peptidylkette frei (nach Stryer, L. (2013) Lehrbuch der Biochemie, Springer)
Abb. 3.12 Vereinfachter Reaktionsmechanismus der Aconitase. Cis-Aconitat bildet sich übergangsweise am Enzym unter Beteiligung eines [4Fe–4S]-Clusters
Abb. 3.13 Channeling der Tryptophan-Synthase. Die α-Untereinheit spaltet die Seitenkette des Substrats ab. Indol als Zwischenprodukt wird durch einen Kanal zur β-Untereinheit weitergereicht und erhält dort die Seitenkette zur Bildung von Tryptophan
Abb. 3.14 Reaktion der D-Xylose-Isomerase. Zur besseren Übersichtlichkeit sind die Zucker in der offenkettigen Form dargestellt
Abb. 3.15 Regulation der Glutamin-Synthetase. Das Schema zeigt rechts die aus dem Glutamin entstehenden Metaboliten, die selbst hemmend auf die Reaktion der Glutamin-Synthetase einwirken
Abb. 3.16 Regulation der Glutamin-Synthetase (GS) durch die Adenylyl-Transferase (AT) mit assoziiertem Regulatorprotein (PII) und die Uridylyl-Transferase (UTase). Grüne Pfeile bedeuten Aktivierung, rote Pfeile Hemmung
4: Allgemeine Eigenschaften von Enzymen, Enzymtests
Abb. 4.1 pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität. Der Farbcode symbolisiert den Grad der Enzymaktivität, grün ist volle, rot keine Aktivität. Nach Vorinkubation des Enzyms bei einem suboptimalen pH-Wert der pH-Aktivitätskurve (blauer Punkt) und anschließender Überführung zum optimalen pH-Wert gewinnt das Enzym seine volle Aktivität zurück (grüner Punkt), bei Inkubation im äußeren Bereich der pH-Stabilitätskurve (gelber Punkt) wird das Enzym auch bei optimalem pH nicht reaktiviert (roter Punkt)
Abb. 4.2 Temperaturabhängigkeit der Enzymaktivität in der direkten Auftragung (a) und der Auftragung nach Arrhenius (b). Der Farbcode symbolisiert die Temperatur. Ist das Enzym längere Zeit der höheren Temperatur ausgesetzt (roter Punkt in b), so verschiebt sich das Temperaturmaximum (rote Linie) zu geringeren Werten (gelber Punkt, gelbe Linie). Die drei durch grüne Punkte markierten Inkubationstemperaturen zeigen unterschiedliches Denaturierungsverhalten des Enzyms, wie in Abb. 4.3 dargestellt.
Abb. 4.3 Verhalten der Aktivität eines Enzyms nach Vorinkubation bei den drei in Abb. 4.2 markierten Temperaturen. Aus der Steigung der Geraden in der halblogarithmischen Auftragung erhält man die Geschwindigkeitskonstante der Denaturierung kinakt bei der entsprechenden Temperatur.
Abb. 4.4 Enzymtest auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen. In Reihe A wird eine Eichkurve für ansteigende Produktmengen erstellt. In den Reihen B–D erfolgen Tests mit unbekannten Enzymproben, deren Aktivität anhand der Eichkurve berechnet werden kann. Die folgenden Reihen sind nicht bearbeitet
Abb. 4.5 Prinzip des Proteinmikroarray-Verfahrens. (a) Auf einer Glasplatte (Biochip) werden mit einem Mikroarray-Printer Proteinproben aufgetragen und immobilisiert (zur Übersichtlichkeit ist nur die erste Reihe gezeigt). Die fertige Platte (b) wird mit primärem Antikörper behandelt, der nach dem Waschschritt nur an den positiv reagierenden Spots verbleibt (c). Diese werden durch einen sekundären, fluoreszenz- oder enzymmarkierten Antikörper sichtbar gemacht und mittels eines Mikroarray-Scanners vermessen
Abb. 4.6 Unkritische Regressionsanalysen führen zu Fehlinterpretationen: (a) Verzerrung der Geraden einer linearen Regression durch einen einzigen stark abweichenden Wert. Die blaue Ausgleichsgerade beschreibt zutreffend den Verlauf der gemessenen Werte. Verschiebt sich ein Punkt, in diesem Fall der letzte der Reihe nach oben, stimmt die nun erhaltene rote Regressionsgerade mit keinem der Messwerte überein. (b) Auch durch eine zusammenhanglose Punktwolke lässt sich eine Ausgleichsgerade berechnen.
Abb. 4.7 Aus direkten Diagrammen (a) abgeleitete Residual-Diagramme (b). Es ist ein hyperboler Kurvenverlauf angenommen, wobei sich die Fehler in der linken Auftragung über den gesamten Messbereich gleichmäßig verteilen, in der rechten Auftragung nimmt die Fehlerintensität mit steigender Konzentration zu
Abb. 4.8 Anpassung einer hyperbolen Kurve an Messwerte mit sigmoider Charakteristik. (a) direkte Auftragung; (b) Residualdiagramm
5: Methoden für Enzymuntersuchungen
Abb. 5.1 Fotometertypen
Abb. 5.2 Schema eines Einstrahlfotometers (a) und eines Doppelstrahlfotometers (b)
Abb. 5.3 Prinzip der Differenzspektroskopie
Abb. 5.4 Auswertung spektroskopischer Titrationen
Abb. 5.5 Absorptionsspektren. (a) Spektren aromatischer Aminosäuren im langwelligen UV-Bereich; (b) typisches Proteinspektrum
Abb. 5.6 Spektren von oxidiertem (blau) und reduziertem (rot) NAD und NADP
Abb. 5.7 Bauschema eines Spektralfluorimeters
Abb. 5.8 Schematische Darstellung der strahlungslosen Fluoreszenzübertragung (FRET)
Abb. 5.9 Polarisationsspektroskopie. Schematische Darstellung des Aufbaus und des Strahlengangs eines ORD-Geräts (a) und eines CD-Geräts (b)
Abb. 5.10 Glaselektrode mit pH-Meter, gekoppelt mit einem pH-Stat. Fällt der pH-Wert infolge der Enzymreaktion unter den Kontrollwert, wird Titrierlösung zugegeben, bis der ursprüngliche pH-Wert wieder erreicht ist. Die zeitabhängige Zugabe der Titrierlösung wird registriert
Abb. 5.11 Continuous-Flow-Apparatur. Die Fotometereinheit mit Lichtquelle und Fotomultiplier bewegt sich mit kontinuierlicher Geschwindigkeit entlang der Beobachtungsröhre
Abb. 5.12 Stopped-Flow-Apparatur
Abb. 5.13 Temperatursprung-Apparatur
Abb. 5.14 Drucksprung-Apparatur
6: Enzymisolierung
Abb. 6.1 Prinzip eines chromatografischen Trennverfahrens. Nach Auftragung der Probe trennen sich Proteinbanden auf, überlappen sich aber noch teilweise. Die farbigen Banden sind unterschiedliche Proteine, die grüne Bande ist das zu reinigende Enzym. Man kann entweder unter Inkaufnahme eines geringeren Reinigungseffekts auf große Ausbeute setzen (gepunktetes Rechteck) oder aber unter Verzicht auf hohe Ausbeute einen größeren Reinigungseffekt erzielen (schraffiertes Rechteck)
Abb. 6.2 Schema einer Dialyse. Das Enzym ist in einem Dialysesack eingeschlossen, der in eine wässrige Lösung eintaucht. Dessen semipermeable Wand können niedermolekulare Komponenten, wie kleine Metaboliten und Salze, nicht aber die Enzymmoleküle passieren. Durch mehrfaches Wechseln der äußeren Lösung lassen sich die niedermolekularen Komponenten praktisch vollständig entfernen
Abb. 6.3 Rohrzuckergradienten-Zentrifugation. Mittels eines Gradientenmischers wird in einem Ultrazentrifugengefäß ein linearer Rohrzuckergradient erzeugt und über diesen die Probe in kleinem Volumen geschichtet. Im Schwerefeld der Ultrazentrifuge trennen sich die Proteine entsprechend ihrer Masse in separate Banden auf
Abb. 6.4 Prinzip der Ionenaustauschchromatografie. Auf einer Ionenaustauschersäule wird die Probe aufgetragen und mittels eines linearen Puffer- oder Salzgradienten eluiert. Die Konzentrationsangaben gelten als Beispiel. Rechts sind Mischgefäße für verschiedene nicht lineare Gradienten gezeigt
Abb. 6.5 Prinzip einer Gelchromatografie. Die Proteine wandern nach ihrer Größe, kleinere langsamer als größere. Nach dem Eluieren können die Banden anhand ihrer Enzymaktivität zugeordnet und in einem Diagramm ihre molare Masse gegen das Elutionsvolumen aufgetragen werden (rechts). Aus der hinreichend linearen Beziehung kann die Größe eines unbekannten Enzyms erhalten werden
Abb. 6.6 Prinzip der Elektrophorese. Bei der einfachen Elektrophorese (links) wandern Proteine entsprechend ihrer Überschusslandung zur Anode oder zur Kathode, die Probe wird in der Mitte zwischen beiden Elektroden aufgetragen. Das gilt auch für die native Polyacrylamidgel-Elektrophorese (Mitte), aufgrund des engen Maschennetzes geht auch die Molekülgröße in die Wanderungsgeschwindigkeit ein. In der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (rechts) zerfallen die nativen Proteine durch Anlagerung von SDS in ihre Untereinheiten. Diese wandern entsprechend ihrer Größe aufgrund der negativen Ladung von SDS ausschließlich zur Anode
7: Ligandenbindung
Abb. 7.1 Hilfestellungen des Enzyms für das Substrat zum Auffinden des aktiven Zentrums
Abb. 7.2 Die Schloss-Schlüssel-Hypothese nimmt eine starre räumliche Entsprechung des Substrats mit dem aktiven Zentrum an
Abb. 7.3 Nach der Induced-Fit-Theorie passt sich das aktive Zentrum dem Substrat an
Abb. 7.4 Übersicht über die Arten der Bindung eines Liganden an ein Enzym
Abb. 7.5 Sättigungskurve der Bindung eines Liganden an ein Enzym. Die Sättigung kann entweder direkt als der Anteil des gebundenen Liganden [A] geb oder als die um die Enzymkonzentration reduzierte Sättigungsfunktion r aufgetragen werden. Dementsprechend werden unterschiedliche Sättigungswerte erhalten. Vollsättigung ergibt sich als Asymptote an die Kurve, bei Halbsättigung wird die Dissoziationskonstante bestimmt; n ist die Anzahl identischer Bindungsstellen des Enzyms
Abb. 7.6 Linearisierung der Sättigungskurve nach Scatchard
Abb. 7.7 Prinzip der Gleichgewichtsdialyse. Eine Dialysezelle ist durch eine semipermeable Membran, die niedermolekulare Ligandennicht aber das Enzym durchlässt, in zwei gleiche Kammern unterteilt. Das Enzym verbleibt in seiner Kammer, der Ligand verteilt sich gleichmäßig auf beide Kammern, in der Enzymkammer addiert sich noch der gebundene Anteil dazu
Abb. 7.8 Schema einer Gleichgewichtsdialyse-Apparatur. Die Kammergröße wird der Probenmenge angepasst und liegt meist im Bereich von 0,1 ml. Während des Dialysevorgangs werden die Zellen temperiert und langsam gedreht
Abb. 7.9 Schema eines Apparats zur Bindungsmessung durch Ultrafiltration. Enzymlösung mit Ligand in variierender Konzentration wird oberhalb der semipermeablen Membran eingefüllt. Bei Anlegen des Gasdrucks tritt nur der freie Ligand durch die Membran und kann bestimmt werden
Abb. 7.10 Oberflächen-Plasmon-Resonanz. Zur Erklärung siehe Text
8: Kinetische Behandlung von Enzymreaktionen
Abb. 8.1 Verlauf einer Reaktion erster Ordnung in der direkten und der halblogarithmischen Auftragung. Die Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung ergibt sich direkt aus der Steigung
Abb. 8.2 Verlauf einer Reaktion zweiter Ordnung in der halblogarithmischen Auftragung. Die zunächst nicht lineare schwarze Kurve geht bei Überschuss der Komponente B1 gegenüber A in eine Reaktion pseudoerster Ordnung mit linearem Verlauf (rot) über. Erhöhung der Konzentration [B1 ] zu [B2 ] bewirkt einen steileren Anstieg (blau). Die Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung ergibt sich aus der Steigung unter Berücksichtigung des Konzentrationsterms
Abb. 8.3 Vergleich von Reaktionen nullter, erster und zweiter Ordnung. Es ist zu beachten, dass die nullte Ordnung und nur diese in der direkten Auftragung einen linearen Verlauf zeigt
Abb. 8.4 Zeitlicher Verlauf einer Enzymreaktion. Drei Phasen bestimmen die Form der Zeit-Umsatz-Kurve, aber nur eine eignet sich zur Bestimmung der Umsatzgeschwindigkeit. Die Darstellung ist schematisch und bezüglich Zeit- und Konzentrationsachse nicht maßstabsgetreu (vgl. Zeitangaben; [A]
Abb. 8.5 Hyperbole Sättigungsfunktion nach der Michaelis-Menten-Gleichung. Vermerkt ist die Methode der Bestimmung der kinetischen Konstanten Km und V (beachte die Ähnlichkeit zur Bindungskurve in Abb. 7.5).
Abb. 8.6 Hyperbel-Transformation der Michaelis-Menten-Gleichung
Abb. 8.7 Umformungen der Michaelis-Menten-Gleichung in drei Geradengleichungen
Abb. 8.8 Linearisierung der hyperbolen Sättigungsfunktion der Michaelis-Menten-Gleichung nach Lineweaver-Burk. Die Methode zur Bestimmung der kinetischen Konstanten und die Verzerrung der Fehlergrenzen bei angenommener Gleichverteilung des Fehlers sind gezeigt
Abb. 8.9 Linearisierungsverfahren nach Hanes
Abb. 8.10 Linearisierungsverfahren nach Eadie-Hofstee
Abb. 8.11 Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit v nach der Tangentenmethode für den Fall eines schnellen und eines langsamen Umsatzes. Die Tangenten sind an den linearen Steady-State-Bereich der jeweiligen Kurve angelegt (mit blauen Rechtecken unterlegt). Die schnelle Reaktion ist auf 1 min bezogen und ergibt direkt die Enzymeinheiten als μmol/min, für die langsame Reaktion wurde zur besseren Bestimmbarkeit ein Zeitabschnitt von 4 min genommen, sodass der Wert dafür geteilt werden muss
9: Enzymhemmung
Abb. 9.1 Unterscheidung zwischen reversibler und irreversibler Hemmung durch Verfolgung der Zeitabhängigkeit
Abb. 9.2 Übersicht über die Arten der reversiblen Hemmung. Das vollständige Schema entspricht der nicht-kompetitiven Hemmung, durch Eliminierung von Teilreaktionen erhält man die anderen Hemmtypen
Abb. 9.3 Reaktionsschema der kompetitiven Hemmung. Produkthemmung folgt dem gleichen Schema, wobei I durch P zu ersetzen ist
Abb. 9.4 Direkte Darstellung der kompetitiven Hemmung bei ansteigender Substratkonzentration. Die Hemmstoffkonzentration bleibt innerhalb der jeweiligen Kurve konstant und ändert sich von Kurve zu Kurve. Oben ist die Geschwindigkeitsgleichung der kompetitiven Hemmung gezeigt
Abb. 9.5 Lineare Darstellungen der kompetitiven Hemmung. Es sind die zugehörigen Gleichungen und für das Lineweaver-Burk-Diagramm die Sekundärauftragung zur direkten Bestimmung der Hemmkonstanten gezeigt
Abb. 9.6 Kompetitive Hemmung in der Abhängigkeit von der Hemmstoffkonzentration in der direkten Auftragung und dem Diagramm nach Dixon. Die zugehörigen Gleichungen sind angegeben
Abb. 9.7 Die verschiedenen Arten der nicht kompetitiven-Hemmung im Lineweaver-Burk-Diagramm und den Sekundärauftragungen zur Bestimmung der Hemmkonstanten
Abb. 9.8 Nicht-kompetitive Hemmung im Hanes- und Eadie-Hofstee-Diagramm mit Angabe der zugehörigen Gleichungen
Abb. 9.9 Schema der unkompetitiven Hemmung
Abb. 9.10 Lineare Darstellungen der unkompetitiven Hemmung mit Angabe der zugehörigen Gleichungen und der Sekundärauftragung zur Bestimmung der Hemmkonstanten
Abb. 9.11 Substrathemmung in der direkten Auftragung (a), im Lineweaver-Burk-Diageamm (b), und im Dixon-Diagramm (c), mit Angabe der zugehörigen Gleichungen. Die Kurven lassen sich in keinem der Diagramme linearisieren
Abb. 9.12 Übersicht über die partiellen Enzymhemmungen. Für k2 > k6 entspricht das Schema der partiell nicht-kompetitiven Hemmung, für k2 = k6 der partiell kompetitiven Hemmung. Bei der partiell unkompetitiven Hemmung entfällt der gesamte schraffierte Bereich
Abb. 9.13 Unterscheidung zwischen vollständiger und partieller Hemmung durch Sekundärauftragungen aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm und durch das Dixon-Diagramm. In beiden Diagrammen ergeben vollständige Hemmungen Geraden, partielle Hemmungen dagegen nicht lineare Kurven, deren Form je nach Hemmtyp unterschiedlich sein kann, die hier gezeigten Kurvenverläufe sind Beispiele
Abb. 9.14 Übersicht über die Arten spezifischer reversibler Enzymhemmungen. Für die einzelnen Hemmtypen sind die Geschwindigkeitsgleichungen gezeigt, die sich durch die angegebenen Vereinfachungen aus der oben gezeigten allgemeinen Form der Gleichung ableiten lassen. Wo keine Änderung vermerkt ist, bleibt die Gleichung unverändert
10: Mehrsubstratreaktionen
Abb. 10.1 Reaktionsschemata der drei Grundtypen von Mehrsubstratreaktionen am Beispiel von Bisubstratreaktionen nach der Schreibweise von W.W. Cleland. Für den geordneten Mechanismus sind die Geschwindigkeitskonstanten der Substrate A, B und der Produkte P, Q, für die anderen beiden Mechanismen die Hemm- bzw. Michaelis-Konstanten angegeben. Für vergleichbare Komponenten und Enzymformen gilt die gleiche Farbcodierung
Abb. 10.2 Lineare Diagramme und Sekundärauftragungen aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm für den Zufallsmechanismus bei unabhängiger Bindung der beiden Substrate, d. h. KiA = KmA , KiB = KmB . Dargestellt ist die Variation des Substrats A bei konstant gehaltenem B, das wiederum von Messreihe zu Messreihe verändert wird. Die gestrichelten Pfeile zeigen das Verfahren zur Erstellung der Sekundärdiagramme
Abb. 10.3 Lineare Diagramme und Sekundärauftragungen aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm für den geordneten Mechanismus bei KiA < KmA , KiB < KmB . Dargestellt ist die Variation des Substrats A bei konstant gehaltenem B, das seinerseits von Messreihe zu Messreihe verändert wird. Die gestrichelten Pfeile zeigen das Verfahren zur Erstellung der Sekundärdiagramme
Abb. 10.4 Lineare Diagramme und Sekundärauftragung aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm für den Ping-Pong-Mechanismus. Dargestellt ist die Variation des Substrats A bei konstant gehaltenem B, das seinerseits von Messreihe zu Messreihe verändert wird. Die gestrichelten Pfeile zeigen das Verfahren zur Erstellung des Sekundärdiagramms
11: Allosterische Enzyme
Abb. 11.1 S-förmige (sigmoide) Sättigungsfunktion eines allosterischen Enzyms, wie sie auch die Bindung von Sauerstoff an Hämoglobin zeigt, im Vergleich zu einer einfachen hyperbolen Sättigungskurve bei unabhängiger Ligandenbindung wie im Falle der Sauerstoff-bindung an Myoglobin
Abb. 11.2 Schematische Darstellung des Symmetrie-Modells am Beispiel eines homotetrameren Enzyms. Die Farbintensitäten der Untereinheiten zeigen die Lage des Gleichgewichts
Abb. 11.3 Regulation der Enzymaktivität durch einen Hemmstoff (a) und einen Aktivator (b) nach dem Symmetrie-Modell
Abb. 11.4 Einfluss von Effektoren auf die Aktivität eines allosterischen Enzyms und die Form der sigmoiden Sättigungskurve
Abb. 11.5 Sättigungsfunktionen mit positiver und negativer Kooperativität im Vergleich zu hyperbolen Sättigungskurven in den linearen Diagrammen der Michaelis-Menten-Gleichung
Abb. 11.6 Sigmoide Sättigungsfunktion in der Auftragung des Hill-Diagramms
Abb. 11.7 Schematische Darstellung des Sequenz-Modells für ein homotetrameres Enzym
Abb. 11.8 Sättigungskurve für negative Kooperativität im Vergleich mit einer hyperbolen Sättigungsfunktion. Die angegebenen Affinitätsbereiche sind überlappend
Abb. 11.9 Halbseitenreaktivität. Enzymmolekül mit vier identischen Bindungsstellen, die Besetzung der ersten beiden behindert die der letzten beiden infolge elektrostatischer Abstoßung
Abb. 11.10 Slow-Transition-Modell. Die Pfeile geben die Richtung des Vorgangs an, dicke Pfeile sind schnelle, dünne gestrichelte langsame Reaktionen. Zwischen allen Enzymformen bestehen Gleichgewichte, auch wenn diese nicht durch entsprechende Pfeilsym bole gekennzeichnet sind. Die Farbintensitäten symbolisieren die relativen Mengen von Substrat, Produkt und Enzymformen. Die schwache Restaktivität, die die inaktive Form in diesem Modell noch besitzt, ist hier nicht berücksichtigt
Abb. 11.11 Zeit-Umsatzkurve eines hysteretischen Enzyms im Vergleich zu einer normalen Zeit-Umsatz-Kurve (die im Bereich von Mikro- bis Millisekunden liegende Pre-Steady-State-Phase ist nicht berücksichtigt)
12: Passgerechte Enzyme: Immobilisierung, Enzymreaktoren und künstliche Enzyme
Abb. 12.1 Immobilisierung von Enzymen. (a) nicht-kovalente Bindung an einem Anionenaustauscher; (b) kovalente Bindung über einen Spacer an eine inerte Matrix
Abb. 12.2 Coimmobilisierung von Enzymen durch Quervernetzung mit Serumalbumin
Abb. 12.3 Immobilisierung von Enzymen durch Mikroverkapselung
Abb. 12.4 Immobilisierung durch Einfangen des Enzyms in einem Polyacrylamind-Netzwerk
Abb. 12.5 Schema eines Rührkesselreaktors
Abb. 12.6 Enzymreaktoren. (a) Umwurfreaktor mit Innenröhre; (b) Kaskadenprinzip, durch Siebplatten getrennte Kammern; (c) Hohlfaserreaktor mit eingeschlossenem Enzym
Abb. 12.7 Festbettreaktor mit Partikeln mit immobilisiertem Enzym
Abb. 12.8 Modelle künstlicher Enzyme. (a) β-Cyclodextrin mit sieben Glucoseeinheiten; (b) räumliches Modell des Cyclodextrins. (c) [18]Krone-6 mit komplexiertem Kaliumion als Beispiel eines Kronenethers
List of Tables
4: Allgemeine Eigenschaften von Enzymen, Enzymtests
Tab. 4.1 Größen zur Charakterisierung der Enzymaktivität
6: Enzymisolierung
Tab. 6.1 Reinigungstabelle. Es ist ein Beispiel einer Reinigungsprozedur gezeigt, RE = Rohextrakt, SA = spezifische Aktivität, U = Enzymeinheiten (IU oder nkat)
8: Kinetische Behandlung von Enzymreaktionen
Tab. 8.1 Fehlerhafte Bestimmung von Maximalgeschwindigkeit V und Michaelis-Konstante Km aus der hyperbolen Sättigungskurve bei nicht sättigender Substratmenge. Die Substratkonzentration ist als Mehrfaches von Km angegeben (Km = 1). Die mittlere Spalte zeigt die bei dieser Substratkonzentration vorliegende Umsatzgeschwindigkeit v. Wertet man v bereits als Maximalgeschwindigkeit aufgrund der unzutreffenden Annahme, dass die Substratkonzentration genügend hoch sei, so erhält man für scheinbare Halbsättigung die in der rechten Spalte angegebenen Werte für Km
13: Enzyme im praktischen Gebrauch
Tab. 13.1 Übersicht über Enzyme in industrieller Anwendung
Tab. 13.2 Übersicht über Enzyme in Medizin und Therapie
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Struktur, Kinetik und Anwendungen
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Soweit wie möglich wurde hinsichtlich Text und Abbildungen besonderer Wert auf leichte Verständlichkeit gelegt, was aber bei schwierigeren Themen wie der Enzymkinetik nicht immer konsequent durchzuhalten ist. Komplexere Abhandlungen wie Ableitung von Formeln, soweit sie nicht, wie die Michaelis-Menten-Gleichung, von zentraler Bedeutung sind, sind in Boxen ausgelagert, sodass
Bezüglich der Nomenklatur orientiert sich dieses Buch im Wesentlichen an den von der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) herausgegebenen Richtlinien, doch finden sich in der einschlägigen Literatur oft andere Schreibweisen, die aber zumeist soweit einsichtig sind, dass es dem Leser beim Vergleich keine wesentlichen Probleme bereiten sollte.
Tübingen, Mai 2015
Hans Bisswanger
Zusatzmaterial: Power-Point Animationen
www.wiley-vch.de/home/EnzymeStrukturKinetik/
Praktische
Das Buch besteht aus zwei Teilen, dem gedruckten Text und dem Zusatzmaterial. Letzteres soll einzelne Themen des Buches anschaulich machen und vertiefen, es berührt nicht alle Themen des Textes. Der Buchtext mit seinen Abbildungen einerseits und das Zusatzmaterial andererseits können unabhängig voneinander studiert werden. Trotzdem sind im Text entsprechende Verweise auf die jeweiligen Folien des Zusatzmaterials, während dort für weitergehende Studien mit dem Symbol
Für die Nutzung des Zusatzmaterials wird eine Grundkenntnis im Umgang mit dem Power-Point-Programm vorausgesetzt. Die Bilder sind im Vorführungsmodus zu betrachten. Ein grüner Pfeil am linken unteren Bildrand zeigt an, dass mit der Maus- bzw. Cursortaste eine Animation auszulösen ist. Solange die Animation läuft, verschwindet der Pfeil und erscheint wieder zur Ausführung des nächsten Schrittes. Erscheint anstelle des Pfeils ein „X“, so ist das betreffende Thema abgeschlossen. Mit der Maus- bzw. Cursortaste wird dann das nächste Thema aufgerufen. Das Thema kann mit einer Folie enden oder aber über mehrere Folien gehen. Die Geschwindigkeit der Animationen ist derart eingestellt, dass diese gut verfolgt werden können. Beim ersten Betrachten mag das Tempo etwas rasch erscheinen, um alles genau aufzunehmen. Es besteht dann die Möglichkeit, in der Pause beim Erscheinen des grünen Pfeils durch Betätigung der Rückwärtstaste den Vorgang nochmals ablaufen zu lassen, sodass genügend Zeit bleibt, sich mit der Materie gründlich zu befassen. Grundsätzlich soll immer das Ende der Animation, also das Erscheinen des grünen Pfeils, abgewartet werden. Zu frühe Betätigung der Cursortaste überschlägt die laufende Animation und lässt unter Umständen das Folgende unverständlich erscheinen.
Gängige Abkürzungen wie
A, B, C… Enzymsubstrate bzw. Enzymliganden
ACP Acyl-Carrier-Protein
ACTase Aspartatcarbamoyl-Transferase
ADH Alkohol-Dehydrogenase
CM Carboxymethyl
CoA Coenzym A
DEAE Diethylaminoethyl
GOD Glucose-Oxidase
I Hemmstoff (Inhibitor) eines Enzyms
k Geschwindigkeitskonstante
k cat katalytische Konstante
K A Dissoziationskonstante des Substrats oder Liganden
K d Dissoziationskonstante
K g Gleichgewichtskonstante der Gesamtreaktion
K i Hemmkonstante
K iA Hemmkonstante des Substrats
K ic kompetitive Hemmkonstante
K iu unkompetitive Hemmkonstante
K m Michaelis-Konstante
K P Dissoziations- bzw. Hemmkonstante des Produkts
LDH Lactat-Dehydrogenase
MDH Malat-Dehydrogenase
P, Q, R… Enzymprodukte
PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese
PALA N -Phosphonacetyl-L-Aspartat
PDH Pyruvat-Dehydrogenase
PFK 6-Phosphofructokinase
Pi anorganisches Phosphat
PLP Pyridoxalphosphat
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PPi anorganisches Diphosphat
RN recommended name , empfohlener Enzymname
SDS Natriumdodecylsulfat
SN systematic name , systematischer Enzymname
SOD Superoxid-Dismutase
ThDP Thiamindiphosphat
THF Tetrahydrofolat
TIM Triosephosphat-Isomerase
v Umsatzgeschwindigkeit
v i Anfangsgeschwindigkeit
V bzw. V max Maximalgeschwindigkeit
auf das Buch verwiesen wird.