Liste der Abkürzungen XVII
1 Informationsmakromoleküle 1
1.1 Informationsverarbeitung und Molekularbiologie 1
1.1.1 Das zentrale Dogma 1
1.1.2 Rekombinante DNA-Technologie 3
1.2 Nukleinsäurestruktur und -funktion 5
1.2.1 Basen 5
1.2.2 Nukleoside 5
1.2.3 Nukleotide 6
1.2.4 Phosphodiesterbindungen 6
1.2.5 DNA/RNA-Sequenz 7
1.2.6 DNA-Doppelhelix 7
1.2.7 A-, B- und Z-Helices 9
1.2.8 RNA-Sekundärstruktur 11
1.2.9 Modifizierte Nukleinsäuren 11
1.2.10 Nukleinsäurefunktion 11
1.3 Proteinstruktur und -funktion 14
1.3.1 Aminosäurestruktur 14
1.3.2 Proteingröße und -formen 16
1.3.3 Primärstruktur 16
1.3.4 Nichtkovalente Wechselwirkungen 17
1.3.5 Sekundärstruktur 18
1.3.6 Tertiärstruktur 19
1.3.7 Quartärstruktur 20
1.3.8 Prosthetische Gruppen 21
1.3.9 Domänen, Motive, Familien und Evolution 21
1.3.10 Proteinfunktion 23
2.1 Chemische und physikalische Eigenschaften von Nukleinsäuren 29
2.1.1 Stabilität von Nukleinsäuren 29
2.1.2 Säureeffekt 30
2.1.3 Alkalieffekt 30
2.1.3.1 DNA 30
2.1.3.2 RNA 30
2.1.4 Chemische Denaturierung 32
2.1.5 Viskosität 32
2.1.6 Schwimmdichte 32
2.2 Spektroskopische und thermische Eigenschaften von Nukleinsäuren 34
2.2.1 UV-Absorption 34
2.2.2 Extinktion und Struktur 34
2.2.3 Mengenbestimmung der Nukleinsäuren 35
2.2.4 Reinheit der DNA 35
2.2.5 Wärmedenaturierung 36
2.2.6 Hybridisierung 37
2.3 DNA-Superspiralisierung 38
2.3.1 Geschlossen-zirkuläre DNA 38
2.3.2 Superspiralisierung 38
2.3.3 Topoisomer 39
2.3.4 Helikale und superhelikale Windungszahl 39
2.3.5 Interkalatoren 40
2.3.6 Superspiralisierungsenergie 41
2.3.7 Topoisomerasen 41
2.4 Chromatinstruktur 44
2.4.1 Chromatin 44
2.4.2 Histone 44
2.4.3 Nukleosomen 45
2.4.4 Die Rolle von H1 46
2.4.5 Linker-DNA 47
2.4.6 Die 30 nm-Faser 48
2.4.7 Höher geordnete Struktur 48
2.5 Eukaryotische Chromosomenstruktur 50
2.5.1 Das Mitosechromosom 50
2.5.2 Das Centromer 51
2.5.3 Telomere 51
2.5.4 Interphasechromosomen 51
2.5.5 Heterochromatin 52
2.5.6 Euchromatin 52
2.5.7 DNase-I-Überempfindlichkeit 52
2.5.8 CpG-Methylierung 52
2.5.9 Histonvarianten und -modifikation 54
3 DNA-Replikation 59
3.1 DNA-Replikation: eine Übersicht 59
3.1.1 Semikonservativer Mechanismus 59
3.1.2 Replikons, Ursprünge und Termini 61
3.1.3 Semidiskontinuierliche Replikation 62
3.1.4 RNA-Primer 63
3.2 Bakterielle DNA-Replikation 64
3.2.1 Experimentelle Systeme 64
3.2.2 Initiation 65
3.2.3 Strangentwindung 67
3.2.4 Elongation 67
3.2.5 Termination und Aufteilung 69
3.3 Eukaryotische DNA-Replikation 70
3.3.1 Experimentelle Systeme 70
3.3.2 Ursprünge und Initiation 70
3.3.3 Replikationsgabeln 71
3.3.4 Kernmatrix 72
3.3.5 Telomerreplikation 72
4 DNA-Schäden, -Reparatur und -Rekombination 77
4.1 DNA-Schäden 77
4.1.1 DNA-Defekte 77
4.1.2 Oxidative Schäden 78
4.1.3 Alkylierung 79
4.1.4 Sperrige Addukte 79
4.2 Mutagenese 81
4.2.1 Mutation 81
4.2.2 Replikationsgenauigkeit 82
4.2.3 Physikalische Mutagene 83
4.2.4 Chemische Mutagene 83
4.2.5 Direkte Mutagenese 83
4.2.6 Indirekte Mutagenese und Transläsions-DNA-Synthese 84
4.3 DNA-Reparatur 87
4.3.1 Photoreaktivierung 87
4.3.2 Alkyltransferase 87
4.3.3 Reparatur von Strangbrüchen 87
4.3.4 Exzisionsreparatur 88
4.3.5 Fehlpaarungsreparatur 90
4.3.6 Erbliche Reparaturdefekte 90
5 Transkription in Bakterien 95
5.1 Grundlagen der Transkription 95
5.1.1 Transkription: eine Übersicht 95
5.1.2 Initiation 95
5.1.3 Elongation 97
5.1.4 Termination 97
5.2 Escherichia coli-RNA-Polymerase 99
5.2.1 RNA-Polymerase-Holoenzym von E. coli 99
5.2.2 a-Untereinheit 99
5.2.3 b-Untereinheit 99
5.2.4 b’-Untereinheit 100
5.2.5 s-Faktor 100
5.3 Der s70-Promotor von E. coli 101
5.3.1 Promotorsequenzen 101
5.3.2 Promotorgröße 102
5.3.3 −10-Sequenz 102
5.3.4 −35-Sequenz 102
5.3.5 Promotoreffizienz 103
5.4 Transkriptionsinitiation, -elongation und -termination 104
5.4.1 Promotorbindung 104
5.4.2 DNA-Entwindung 105
5.4.3 Initiation der RNA-Kette 105
5.4.4 Elongation der RNA-Kette 105
5.4.5 Termination der RNA-Kette 106
5.4.6 Rho-abhängige Termination 108
6 Regulation der Transkription in Bakterien 113
6.1 Das lac-Operon 113
6.1.1 Das Operon 113
6.1.2 Das Lactose(lac)-Operon 113
6.1.3 Der Lac-Repressor 114
6.1.4 Induktion 115
6.1.5 Katabolit-Aktivatorprotein 116
6.2 Das trp-Operon 117
6.2.1 Das Tryptophan(trp)-Operon 117
6.2.2 Der Trp-Repressor 118
6.2.3 Der Attenuator 118
6.2.4 Struktur der RNA-Leitsequenz 119
6.2.5 Das Leitpeptid 119
6.2.6 Attenuation 119
6.2.7 Die Bedeutung der Attenuation 121
7 Transkription in Eukaryoten und Regulation der eukaryotischen Transkription 125
7.1 Die drei RNA-Polymerasen: Charakterisierung und Funktion 125
7.1.1 Eukaryotische RNA-Polymerasen 125
7.1.2 RNA-Polymerase-Untereinheiten 126
7.1.3 Aktivitäten eukaryotischer RNA-Polymerasen 126
7.1.4 Die CTD der RNA-Pol II 126
7.2 RNA-Pol-I-Gene: die ribosomale Wiederholung 128
7.2.1 Ribosomale RNA-Gene 128
7.2.2 Die Rolle des Nukleolus 128
7.2.3 RNA-Pol-I-Promotoren 129
7.2.4 Upstream binding factor 129
7.2.5 Selektivitätsfaktor 1 129
7.2.6 TBP und TAFIs 131
7.3 RNA-Pol-III-Gene: 5S- und tRNA-Transkription 132
7.3.1 RNA-Polymerase III 132
7.3.2 tRNA-Gene 132
7.3.3 5S-rRNA-Gene 133
7.3.4 Alternative RNA-Pol-III-Promotoren 135
7.3.5 RNA-Pol-III-Termination 135
7.4 RNA-Pol-II-Gene: Promotoren und Enhancer 136
7.4.1 RNA-Polymerase II 136
7.4.2 Promotoren 137
7.4.3 Stromaufwärtige Regulationselemente (URE) 137
7.4.4 Verstärkerelemente (Enhancer) 138
7.5 Allgemeine Transkriptionsfaktoren und RNA-Pol-II-Initiation 139
7.5.1 Basale RNA-Pol-II-Transkriptionsfaktoren 139
7.5.2 TFIID 139
7.5.3 TBP 141
7.5.4 TFIIA 141
7.5.5 TFIIB- und RNA-Polymerasebindung 141
7.5.6 Nach der RNA-Polymerase bindende Faktoren 141
7.5.7 CTD-Phosphorylierung durch TFIIH 142
7.5.8 Der Initiatortranskriptionskomplex 142
7.6 Eukaryotische Transkriptionsfaktoren 143
7.6.1 Transkriptionsfaktordomänenstruktur 143
7.6.2 DNA-Bindungsdomänen 144
7.6.2.1 Die Helix-Kehre-Helix-Domäne 144
7.6.2.2 Die Zinkfingerdomäne 145
7.6.2.3 Die basische Domäne 146
7.6.3 Dimerisierungsdomänen 146
7.6.3.1 Leucin-Zipper 146
7.6.3.2 Die Helix-Schleife-Helix-Domäne 147
7.6.4 Transkriptionsaktivierungsdomänen 147
7.6.4.1 Saure Aktivierungsdomänen 147
7.6.4.2 Glutaminreiche Domänen 147
7.6.4.3 Prolinreiche Domänen 147
7.6.5 Repressordomänen 148
7.6.6 Ziele von Transkriptionsregulatoren 148
7.6.7 Chromatinmodifikation 149
8 Der genetische Code und tRNA 155
8.1 Der genetische Code 155
8.1.1 Grundlagen 155
8.1.2 Entschlüsselung 156
8.1.3 Degeneriertheit, Universalität und Doppeldeutigkeit 156
8.1.4 Mutationswirkung 158
8.1.5 Offene Leseraster (ORFs) 159
8.1.6 Überlappende Gene 159
8.2 tRNA-Struktur und -funktion 161
8.2.1 tRNA-Primärstruktur 161
8.2.2 tRNA-Sekundärstruktur 161
8.2.3 tRNA-Tertiärstruktur 163
8.2.4 tRNA-Funktion 163
8.2.5 Aminoacylierung der tRNAs 164
8.2.6 Aminoacyl-tRNA-Synthetasen 164
8.2.7 Korrekturlesen 166
9 Proteinsynthese 169
9.1 Aspekte der Proteinsynthese 169
9.1.1 Codon-Anticodon-Wechselwirkung 169
9.1.2 Wobble 169
9.1.3 Ribosomenbindungsstelle 171
9.1.4 Initiator-tRNA 171
9.1.5 Polysomen 171
9.2 Proteinsynthesemechanismus 173
9.2.1 Übersicht 173
9.2.2 Initiation 174
9.2.3 Elongation 178
9.2.4 Termination 179
9.3 Initiation in Eukaryoten 181
9.3.1 Übersicht 181
9.3.2 Abtasten 182
9.3.3 Initiation 182
9.3.4 Elongation 184
9.3.5 Termination 185
9.4 Translationskontrolle und posttranslationale Ereignisse 186
9.4.1 Translationskontrolle in Bakterien 186
9.4.2 Translationskontrolle in Eukaryoten 187
9.4.3 Polyproteine 189
9.4.4 Protein-Targeting 189
9.4.5 Proteinfaltung und -modifikation 191
9.4.6 Proteinabbau 192
10 Genmanipulation 197
10.1 DNA-Klonierung: eine Übersicht 197
10.1.1 DNA-Klonierung 197
10.1.2 Wirte und Vektoren 198
10.1.3 Subklonierung 199
10.1.4 DNA-Bibliotheken 200
10.1.5 Durchsuchen von Bibliotheken 200
10.1.6 Analyse eines Klons 201
10.2 Präparation von DNA-Plasmiden 203
10.2.1 Plasmide als Vektoren 203
10.2.2 Plasmid-Minipräparation 203
10.2.3 Alkalische Lyse 203
10.2.4 Plasmidreinigung 205
10.2.5 Ethanolfällung 205
10.2.6 Cäsiumchlorid-Gradient 205
10.3 Restriktionsenzyme und Elektrophorese 207
10.3.1 Restriktionsendonukleasen 207
10.3.2 Erkennungssequenzen 207
10.3.3 Kohäsive Enden 208
10.3.4 Restriktionsverdau 209
10.3.5 Agarose-Gelelektrophorese 210
10.3.6 Isolierung der Fragmente 212
10.4 Ligation, Transformation und Analyse von Rekombinanten 213
10.4.1 DNA-Ligation 213
10.4.2 Rekombinante DNA-Moleküle 214
10.4.3 Alkalische Phosphatase 215
10.4.4 Transformation 216
10.4.5 Selektion 217
10.4.6 Transformationseffizienz 217
10.4.7 Überprüfung auf Transformanten 217
10.4.8 Wachstum und Aufbewahrung der Transformanten 218
10.4.9 Gelanalyse 218
10.4.10 Fragmentausrichtung 218
10.4.11 Neue Subklonierungsmethoden 219
11 Klonierungsvektoren 223
11.1 Plasmidvektor-Design 223
11.1.1 Ligationsprodukte 223
11.1.2 Blau-weiß-Screening 223
11.1.3 Mehrfachklonierungsstellen 224
11.1.4 Transkription klonierter eingefügter Abschnitte 225
11.1.5 Expressionsvektoren 225
11.1.6 Gateway® – Subklonierung durch Rekombination 226
11.2 Bakteriophagen, Cosmide, YACs und BACs 229
11.2.1 Bakteriophage l 229
11.2.2 l-Ersatzvektoren 230
11.2.3 Verpackung und Infektion 231
11.2.4 Plaquebildung 232
11.2.5 l-Lysogene 232
11.2.6 M13-Phage-Vektoren 233
11.2.7 Klonierung großer DNA-Fragmente 233
11.2.8 Cosmidvektoren 234
11.2.9 YAC-Vektoren 234
11.2.10 Selektion in Hefe 236
11.2.11 BAC-Vektoren 237
11.3 Eukaryotische Vektoren 239
11.3.1 Klonierung in Eukaryoten 239
11.3.2 Transfektion eukaryotischer Zellen 239
11.3.3 Pendelvektoren 240
11.3.4 Episomale Hefeplasmide 240
11.3.5 Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens 241
11.3.6 Virale Transduktion 242
11.3.7 Baculoviren 243
12 Analyse und Verwendung klonierter DNA 247
12.1 Charakterisierung von Klonen 247
12.1.1 Charakterisierung 247
12.1.2 Restriktionskartierung 248
12.1.3 Markierung von Nukleinsäuren 249
12.1.4 Southern und Northern Blot 250
12.2 Nukleinsäuresequenzierung 252
12.2.1 DNA-Sequenzierung nach Sanger 252
12.2.2 Schrotschusssequenzierung 254
12.2.3 Emulsion-PCR 255
12.2.4 Reversible Fluoreszenz-Abbruchsequenzierung 255
12.2.5 Pyrosequenzierung 256
12.2.6 Sequenzierung durch Ligation und andere Methoden 257
12.2.7 RNA-Sequenzierung 257
12.3 Polymerase-Kettenreaktion 259
12.3.1 PCR 259
12.3.2 Der PCR-Zyklus 259
12.3.3 Matrize und Primer 261
12.3.4 Enzyme 262
12.3.5 PCR-Optimierung 263
12.3.6 RT-PCR und RACE 263
12.3.7 Echtzeit- und quantitative PCR 264
12.4 Analyse klonierter Gene 266
12.4.1 Sequenzorganisation 266
12.4.2 S1-Nuklease-Kartierung 267
12.4.3 Primer-Verlängerung 268
12.4.4 Gelverzögerung 268
12.4.5 DNase-I-Fußabdruck 269
12.4.6 Reportergene 269
12.5 Mutagenese klonierter Gene 271
12.5.1 Mutagenesearten 271
12.5.2 Ortsgerichtete Mutagenese 271
12.5.3 Insertions-/Deletionsmutagenese 272
12.5.4 Zufallsmutagenese durch PCR 273
13 Funktionelle Genomik und die neuen Technologien 277
13.1 Einführung in die ’Omik-Wissenschaften 277
13.1.1 Genomik 277
13.1.2 Transkriptomik 278
13.1.3 Proteomik 279
13.1.4 Metabolomik 280
13.1.5 Andere ’Omik-Wissenschaften 280
13.2 Allgemeine Genexpressionsanalyse 282
13.2.1 Genomweite Analyse 282
13.2.2 DNA-Mikroarrays 283
13.2.3 Chromatinimmunpräzipitation 285
13.2.4 Gen-Knockouts 286
13.2.5 RNA-Knockdown 288
13.3 Proteomik 290
13.3.1 Proteomik 290
13.3.2 Protein-Protein-Wechselwirkungen 292
13.3.3 Zwei-Hybrid-Analyse 293
13.3.4 Protein-Arrays 295
13.4 Zelluläre und molekulare Bildgebung 296
13.4.1 Zelluläre Bildgebung 296
13.4.2 Bildgebung biologischer Moleküle in fixierten Zellen 296
13.4.3 Detektion von Molekülen in lebenden Zellen und Geweben 298
13.4.4 Fluoreszierende Proteine und Reportergene 299
13.5 Transgene und Stammzelltechnologie 301
13.5.1 Genetisch veränderte und transgene Organismen 301
13.5.2 Stammzellen 302
13.5.3 Induzierte pluripotente Stammzellen 303
13.5.4 Gen- und Zelltherapie 304
13.6 Bioinformatik 306
13.6.1 Definition und Anwendungsbereich 306
13.6.2 Anwendungen der Bioinformatik 307
13.6.3 Suche nach Sequenzähnlichkeiten 309
13.6.4 Mehrfachsequenzvergleich 312
13.6.5 Phylogenetische Bäume 313
13.6.6 Strukturelle Bioinformatik 314
13.7 System- und synthetische Biologie 318
13.7.1 Systembiologie 318
13.7.2 Netzwerkbiologie 319
13.7.3 Netzwerkmotive 319
13.7.4 Quantitative Biologie 320
13.7.5 Quantitative mathematische Modelle 321
13.7.6 Integration über biologische Größenordnungen hinweg 321
13.7.7 Synthetische Biologie 322
Richtig gelöst ... 327
Mehr zum Thema 331
Stichwortverzeichnis 337